Development of a 3D bronchial epithelium model for nanotoxicology : analysis of the protein corona formation on silver nanoparticles in the secretome - Unité de Biologie Fonctionnelle et Adaptative Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Development of a 3D bronchial epithelium model for nanotoxicology : analysis of the protein corona formation on silver nanoparticles in the secretome

Développement d'un modèle 3D d'épithélium bronchique pour la nanotoxicologie : analyse de la formation d'une couronne de protéines autour des nanoparticules d'argent dans le sécrétome

Résumé

Over the last years, the production and use of nanomaterials (NMs) in the industry have increased exponentially and NMs have become a potential hazard for human health. As a large number of NMs need to be tested for toxicity, in vitro models have become essential for NM toxicity assessment. To investigate the biological effects of silver nanoparticles (AgNPs) on the lung, we have developed a 3D cell culture model of the human bronchial epithelium using the Calu-3 cell line. We analysed the composition of the apical secretome over time and characterized the formation of the protein corona on AgNPs in the mucus. Calu-3 were grown at the air-liquid interface (ALI) on porous inserts with a 3 µm pore diameter and reduced fetal bovine serum supplementation. The measurement of the transepithelial electrical resistance, the permeability of Lucifer Yellow dye and the immunolabelling of the tight-junction associated zonula occludens-1 protein showed that the epithelium integrity was maintained for 28 days at ALI. The composition of the apical secretome of Calu-3 cells at ALI was analysed by LC-MS/MS and compared to the secretome of primary normal human bronchial epithelial (NHBE) cells from 3 different donors. In total, 408 common extracellular proteins were identified in Calu-3 and NHBE models. The secretion of gel-forming mucins (MUC5AC, MUC5B), as well as antimicrobial peptides (lysozyme, lipocalin-2, and clusterin), demonstrates the functionality of the Calu-3 model. The Calu-3 epithelial barrier was exposed to 10 µg/cm² of AgNPs without any effect on the cell viability until 48 hrs. However, overexpression of proteins involved in the anti-oxidant, inflammation and metal defence pathways such as heme-oxygenase, IL-6 and IL-8 cytokines, and metallothionein was observed. The formation of the protein corona on AgNPs was investigated in the secretome with cells ('cellular corona') or following secretome collection ('acellular corona'). The biological processes associated with the adsorbed proteins such as cell activation, transport, response to stimulus, cellular metabolic process and response to chemical, were enriched in the protein corona. Furthermore, AgNPs pre-incubated in the secretome induced a different pro-inflammatory response in THP-1 derived macrophages compared to bare nanoparticles. The new biological identity of AgNPs acquired in the bronchial mucus may favour the activation of immune cells and facilitate their uptake by macrophages. To conclude, a functional in vitro 3D cell culture model of the human bronchial epithelium was developed. It is currently implemented to assess the long-term toxicity of NM in vitro. Calu-3 cells produced a secretome with a protective function highly similar to the one produced by primary cell cultures. This work sheds light on the major role of the protein corona in driving the immune response to NMs in the lung.
Au cours des dernières années, la production et l'utilisation de nanomatériaux (NMs) dans l'industrie ont augmenté de façon exponentielle et les NMs représentent un danger potentiel pour la santé humaine. L'utilisation de modèles in vitro apparait comme une solution pour prendre en charge l'évaluation de la toxicité d'une très grande diversité de NM à tester. Pour étudier les effets biologiques de nanoparticules d'argent (AgNPs) sur le poumon, nous avons développé un modèle de culture 3D d'épithélium bronchique humain avec la lignée cellulaire Calu-3. Nous avons analysé la composition du sécrétome apical au cours du temps et caractérisé la composition de la couronne de protéines adsorbés autour des AgNPs en présence du sécrétome. Les Calu-3 ont été cultivées à l'interface air liquide (ALI) sur des inserts d'une porosité de 3 µm et une supplémentation réduite en sérum foetal bovin. La mesure de la résistance électrique transépithéliale, la perméabilité du colorant Lucifer Yellow et l'immunomarquage de la protéine zonula occludens-1 associée aux jonctions serrées ont montré que l'intégrité de l'épithélium était maintenue pendant 28 jours à l'ALI. La composition du sécrétome apical des cellules Calu-3 à l'ALI a été analysée par LC-MS/MS et comparée au sécrétome d'épithéliums bronchiques humaines normaux (NHBE) provenant de 3 donneurs différents. Au total, 408 protéines extracellulaires communes ont été identifiées dans les modèles Calu-3 et NHBE. La sécrétion de mucines formant le gel de mucus (MUC5AC, MUC5B), ainsi que de peptides antimicrobiens (lysozyme, lipocaline-2 et clusterine) démontrent la fonctionnalité du modèle Calu-3. La barrière épithéliale du modèle Calu-3 a été exposée à 10 µg/cm² d'AgNPs. Aucun effet sur la viabilité cellulaire n'a été observé pendant 48 heures. Cependant, une surexpression des gènes impliqués dans les voies de défense anti-oxydante, inflammatoire et métallique telles que l'hème-oxygénase, les cytokines IL-6 et IL-8, et la métallothionéine a été observée. La composition de la couronne protéique adsorbée sur les AgNPs a été étudiée en présence des cellules ('couronne cellulaire') ou après la collecte du sécrétome ('couronne acellulaire'). Un enrichissement en protéines impliquées dans les processus biologiques associés aux protéines adsorbées, tels que l'activation cellulaire, le transport, la réponse à un stimulus, les processus métaboliques cellulaires et la réponse à un produit chimique, a été observé dans la couronne protéique. Par ailleurs, les AgNPs pré-incubées dans le sécrétome ont induit une réponse pro-inflammatoire différente dans les macrophages dérivés du THP-1 par rapport aux NP nues. La nouvelle identité biologique des AgNPs acquise dans le sécrétome bronchique pourrait favoriser l'activation des cellules immunitaires et faciliter leur absorption par les macrophages. En conclusion, un modèle fonctionnel in vitro de culture en 3D d'épithélium bronchique humain a été développé. Il est actuellement mis en ouvre pour évaluer la toxicité à long terme des NM in vitro. Les cellules Calu-3 ont produit un sécrétome à fonction protectrice très similaire à celui produit par les cultures de cellules primaires. Ce travail met en lumière le rôle majeur de la couronne protéine dans la réponse immunitaire aux NMs dans le poumon.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03891067 , version 1 (09-12-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03891067 , version 1

Citer

Daniel Sanchez Guzman. Development of a 3D bronchial epithelium model for nanotoxicology : analysis of the protein corona formation on silver nanoparticles in the secretome. Toxicology. Université Paris Cité, 2021. English. ⟨NNT : 2021UNIP5040⟩. ⟨tel-03891067⟩
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