Deciphering netrin-1 signalling function in pluripotent stem cells
Décryptage de la fonction de la voie de signalisation nétrine-1 dans les cellules souches pluripotentes
Résumé
Mouse embryonic stem (mESC) cells are an incredibly useful model to study pluripotency and development in vitro. They present two characteristic properties, the ability to self-renew and to differentiate into all three germ layers of the embryo. Multiple intermediates of pluripotency harboring different molecular and functional properties have been described in vivo and can be captured in vitro. Thus, pluripotency is not the unique state it was once thought to be but rather a continuum of dynamic cellular configurations. Netrin-1 (Ntn1) is a secreted laminin-like protein that was first discovered as a guidance molecule for axon growth during the development of the nervous system. Recently, our lab described that Ntn1 improved the efficiency of reprogramming and regulated pluripotency maintenance (Ozmadenci et al., 2015). During my PhD, I explored in depth the function and dynamic of the Ntn1 signalling pathway in mESC. Firstly, we demonstrated that Ntn1 and its two receptors Neogenin (Neo1) and Unc5b were important positive regulators of naive pluripotency (Huyghe et al., 2020). Together, they inhibit the MAPK signalling pathway and activate the WNT pathway. We also showed that this signalling pathway had a role in the homeostasis of the pluripotent compartment of the blastocyst in vivo. Secondly, to dissect such a dynamic and the regulation of this pathway in pluripotent cells, we established a tricolor fluorescent knock-in reporter mESC line for the endogenous expression of Ntn1, Neo1 or Unc5b using the CRISPR-Cas9 technique. We first demonstrated that the mESC culture was heterogeneous and that different subpopulations of cells expressing or not Ntn1, Neo1 and Unc5b coexist in culture. We further characterized these subpopulations and reported that they differ at the functional and proteic levels. Next, we discovered that the variability of the expression of Ntn1 and Neo1, but not of Unc5b, was tightly linked to the cell cycle. We performed a small-scale shRNA screen to find regulators of their expression and identified some actors of the cell cycle as such. Finally, we showed that strong Ntn1 expression during the S phase of the cell cycle contributes to the increased clonogenicity of those cells. Altogether, these results highlight for the first time how a critical signalling pathway is regulated by the cell cycle in pluripotent cells, potentially modulating the sensitivity to differentiation cues thanks to the positive role of the Ntn1 pathway on mESC pluripotency.
Les cellule souches embryonnaires (CSE) de souris constituent un modèle remarquablement utile pour l’étude in vitro de la pluripotence et du développement. Elles présentent deux propriétés caractéristiques : elles sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en chacun des trois lignages de l’embryon. Plusieurs intermédiaires de la pluripotence ont récemment été capturés in vitro et identifiés in vivo, avec chacun leurs propriétés moléculaires et fonctionnelles. Ainsi, la pluripotence n’est pas l’état unique défini par le passé, mais plutôt un continuum dynamique de configurations cellulaires variées. La Nétrine-1 (Ntn1) est une protéine sécrétée similaire à la laminine qui a été découverte comme facteur de guidage axonale durant le développement du système nerveux. Récemment, notre laboratoire a montré que Ntn1 améliore l’efficacité de la reprogrammation et régule le maintien de la pluripotence (Ozmadenci et al., 2015). Durant ma thèse, j’ai exploré en détail la fonction et la dynamique de la voie de signalisation Ntn1 dans les CSE murines. Dans un premier temps, nous avons montré que la Ntn1 et ses récepteurs Unc5b et Néogénine (Neo1) étaient d’importants régulateurs positifs de la pluripotence naïve (Huyghe et al., 2020). Ensemble, ils inhibent la voie de signalisation MAPK et activent la voie WNT. Nous avons également découvert que cette voie de signalisation jouait un rôle dans l’homéostasie du compartiment pluripotent du blastocyste in vivo. Dans un second temps, nous avons utilisé le système CRISPR-Cas9 pour établir par knock-in un rapporteur fluorescent tricolore pour l’expression endogène de Ntn1, Neo1 et Unc5b. Nous avons tout d’abord démontré que la culture de CSE était hétérogène pour leur expression, et que des populations exprimant différents niveaux de Ntn1, Neo1 et Unc5b coexistaient. La caractérisation poussée des sous-populations a révélé que ces cellules possédaient des propriétés fonctionnelles et des profils d’expression protéiques différents. Par la suite, nous avons découvert que la variabilité de l’expression de Ntn1 et Neo1, mais pas d’Unc5b, était étroitement liée au cycle cellulaire. La mise au point d’un crible shARN nous a permis d’identifier des acteurs du cycle comme régulateurs de leur expression. Enfin, nous avons montré que l’expression renforcée de Ntn1 contribuait à l’augmentation de la clonogénicité des cellules durant la phase S. Ces résultats mettent donc ainsi en évidence pour la première fois la régulation par le cycle cellulaire de l’expression du ligand et des récepteurs d’une voie de signalisation, modulant ainsi potentiellement la sensibilité des cellules aux signaux de différenciation grâce à l’action de la voie Nétrine sur la pluripotence des CSE.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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