Identification of proteins involved in the fate of uranium in the plant Arabidopsis thaliana and the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Identification de protéines impliquées dans le devenir de l'uranium dans la plante Arabidopsis thaliana et la levure Saccharomyces cerevisiae.
Résumé
Uranium is a naturally-occurring radionuclide in the Earth’s crust. It is mainly redistributed in the environment by anthropogenic activities such as uranium and phosphate mining, nuclear industry, military activities and soil fertilization. Uranium may locally accumulate to concentrations that can lead to potential risks for ecosystems, agrosystems, and ultimately human health. Indeed, this radionuclide is chemotoxic and potentially radiotoxic (natural uranium has low specific activity) for all living organisms. Even if uranium is not essential for plants, it is taken up from the soil, incorporated into the biomass, and eventually, can enters the food chain. Thus, contamination of soils by uranium and its absorption by plants represent a significant health risk for humans. The aim of my PhD project is to improve the knowledge of the molecular mechanisms governing the fate of uranium in plant. This project is divided into two parts: the first aims to identify uranium transporters, the second to identify proteins that could be cellular targets for uranium.In the first part, we used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a unicellular eucaryote model that allows us to overpass constraints related to study complex multicellular organisms as higher plants. This organism is particularly relevant to identify metal transporters in plants because of the great conservation of genetic heritage between these two organisms. Thus, we have identified, for the first time, a transporter capable of transporting uranium in a living organism. First, a metabolism-dependent uranium transport was highlighted and characterized. Then, competitive experiments with essential metals allowed us to identify calcium, iron and copper absorption pathways as potential routes for uranium uptake. A study of various mutants revealed that mid1, cch1 and ftr1 mutants, affected in calcium (MID1/CCH1 channel) and Fe3+ (FTR1) transport respectively, also exhibited highly reduced uranium uptake. Ectopic expression of the MID1 gene into the mid1 mutant restored uranium uptake levels of the wild type strain demonstrating that the MID1/CCH1 calcium channel is involved in uranium absorption process in yeast.In the second part, by using metalloproteomic approaches combining column chromatographic fractionation analyses, protein identification by mass spectrometry (LC-MS/MS) and metal quantification by induced coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), we identified 53 candidate proteins for uranium binding in vivo. One of these proteins, GRP7, was overproduced and further biochemically characterized in more detail. After demonstrating its ability to bind uranium in vitro, we initiated its structural analysis by structural nuclear magnetic resonance (NMR) to identify uranium binding sites.Taken together, this new fundamental knowledge could lead to the development of several biotechnological approaches to control uranium pollution in the environment.
L’uranium est un radionucléide naturellement présent dans la croûte terrestre. Il est principalement redistribué dans l’environnement par les activités anthropiques comme l’extraction de l’uranium ou de phosphate, l’industrie nucléaire, les activités militaires ou encore la fertilisation des sols. L’uranium peut localement s’accumuler à des concentrations pouvant entraîner des risques potentiels pour les écosystèmes, agrosystèmes, et la santé humaine. En effet, ce radionucléide présente des risques chimiotoxiques et radiotoxiques pour tous les êtres vivants. Même si l’uranium n’est pas essentiel pour les plantes, il est prélevé dans le sol par celles-ci, incorporé dans la biomasse et, à terme, entre dans la chaîne alimentaire représentant un risque sanitaire pour les êtres vivants. Le but de mon projet de thèse est d’approfondir les connaissances des mécanismes moléculaires gouvernant le devenir de l’uranium dans la plante. Ce projet se décompose en deux volets : un premier ayant pour objectif l’identification de transporteurs d’uranium et un second l’identification des cibles cellulaires protéiques de l’uranium dans la plante.Dans le premier volet, j’ai utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae comme organisme eucaryote modèle permettant de nous affranchir des contraintes intrinsèques à l’étude de la plante. La grande conservation du patrimoine génétique entre ces deux organismes rend cet organisme modèle particulièrement pertinent pour l’identification de transporteurs métalliques. J’ai identifié, pour la première fois, un transporteur responsable de l’entrée d’uranium dans une cellule vivante. Ainsi, après avoir mis en évidence et caractérisé un transport d’uranium dépendant du métabolisme chez la levure, des expériences de compétition métallique avec des métaux essentiels m’ont permis d’identifier les voies d’absorption de calcium, fer et cuivre comme points d’entrée possibles de l’uranium. Une étude de mutants affectés dans ces voies de transport a révélé que les mutants mid1, cch1 et ftr1, respectivement affectés dans le transport de calcium (canal MID1/CCH1) et de Fe3+ (FTR1), présentaient également une absorption d’uranium fortement réduite. L’expression ectopique du gène sauvage MID1 dans le mutant mid1 a permis de rétablir les niveaux d’absorption d’uranium de la souche sauvage démontrant l’implication du canal calcique MID1/CCH1 dans l’entrée d’uranium dans la levure.Dans le second volet, 53 protéines candidates pour la fixation de l’uranium in vivo ont été identifiées en utilisant des approches métalloprotéomiques combinant fractionnements chromatographiques, identification des protéines par spectrométrie de masse et des métaux par spectrométrie de masse couplée à une torche à plasma. Ces cibles cellulaires pourraient être responsables de la toxicité de l’uranium dans la plante ou jouer un rôle dans sa détoxication. Une de ces protéines candidates, GRP7, a été surproduite et caractérisée plus en détail. Après avoir démontré sa capacité à lier l’uranium in vitro, son analyse structurale a été initié par résonance magnétique nucléaire structurale dans le but d’identifier les sites de fixation de l’uranium.Ensemble, ces nouvelles connaissances fondamentales pourraient conduire au développement de plusieurs approches biotechnologiques pour, à terme, mieux contrôler la dissémination de l’uranium dans l’environnement.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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