Adaptive optics based on extended-source wavefront sensing and light-sheet microscopy for high resolution in vivo imaging
Optique adaptative basée sur la mesure de front d’onde en source étendue pour la microscopie à feuille de lumière à haute résolution
Résumé
The use of light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) is a technique of choice for high spatial and temporal resolution 3D imaging of living samples. However, at depth in biological samples, optical aberrations induced by tissue refractive index inhomogeneity result in a significant loss of contrast and spatial resolution. To compensate for these aberrations and thus recover an image limited only by diffraction, we have combined an LSFM microscope with adaptive optics (AO) based on direct wavefront measurement with an extended-source Shack-Hartmann wavefront sensor(ESSH). This original approach leads to efficient and rapid wavefront correction, as it does not require the iterative algorithms used in sensorless AO configurations, and to easier implementation compatible with the study of living samples, as it does not require the invasive insertion of fluorescent beads or the complex and costly use of a pulsed laser to generate a guide star. However, performance in such an instrument is subject to the geometry of the excitation: the ESSH sensor performs a wavefront measurement averaged over the fluorescent volume imaged by the microlenses of which it is composed, and fixed by the thickness of the light-sheet. To optimize wavefront measurement and correction, and consequently the gain provided by the AO, it is necessary to minimize the thickness of the light sheet at illumination over the entire field of view of the ESSH sensor, ideally to make it equal to the depth of field of the collection objective. This is made possible by a recently developed LSFM configuration, axially swept light-sheet microscopy, which achieves a light-sheet thickness of less than 1 micrometer while maintaining a field of view of 500 x 500 µm². I present the implementation of this high-spatial-resolution light-sheet microscope, combined with an adaptive optics loop based on extended-source wavefront measurement, its characterization and performance, as well as in-depth imaging results on live zebrafish larvae.
L'utilisation de la microscopie de fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est une technique de choix pour l’imagerie 3D à hautes résolutions spatiales et temporelle d'échantillons vivants. Néanmoins, en profondeur dans les échantillons biologiques, les aberrations optiques induites par l'inhomogénéité de l'indice de réfraction des tissus entraînent une perte significative de contraste et de résolution spatiale. Pour compenser ces aberrations et ainsi retrouver une image limitée uniquement par la diffraction, nous avons combiné un microscope LSFM avec de l'optique adaptative (OA) basée sur la mesure directe du front d'onde avec un analyseur de front d'onde Shack-Hartmann en source étendue (ESSH). Cette approche originale conduit à une correction efficace et rapide du front d'onde puisqu'elle ne nécessite pas d'algorithmes itératifs utilisés dans les configurations d'OA sans capteur, et à une mise en œuvre plus facile et compatible avec l'étude d'échantillons vivants, car elle ne requiert pas l'insertion invasive de billes fluorescentes ni l'utilisation complexe et coûteuse d'un laser impulsionnel pour générer une étoile guide. Cependant, les performances dans un tel instrument sont assujetties à la géométrie de l'excitation : le capteur ESSH réalise une mesure de front d’onde moyenne sur le volume fluorescent imagé par les microlentilles qui le composent et fixé par l'épaisseur de la feuille de lumière. Afin d'optimiser la mesure et la correction du front d’onde, et par conséquent le gain apporté par l’OA, il est nécessaire de minimiser l'épaisseur de la feuille de lumière à l'illumination sur tout le champ de vision du capteur ESSH, idéalement de la rendre égale à la profondeur de champ de l'objectif de collection. Ceci est possible grâce à une configuration de LSFM développée récemment, la microscopie à feuille de lumière balayée axialement, qui permet d'obtenir une feuille de lumière d'une épaisseur inférieure à 1 micromètre tout en conservant un champ de vue de 500 x 500 µm². Je présente la mise en œuvre de ce microscope à feuille de lumière à haute résolution spatiale, combiné à une boucle d'optique adaptative basée sur une mesure de front d'onde en source étendue, sa caractérisation et ses performances, ainsi que des résultats d'imagerie en profondeur sur des larves de poissons-zèbres vivantes.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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