Visualising the self-assembly mechanism of icosahedral viruses through fluorescence microscopy at the single molecule level
Étude du mécanisme d’auto-assemblage de virus icosaédriques en microscopie de fluorescence à l’échelle de la molécule unique
Résumé
The diversity of viruses we are facing dictated us to learn how to live with them. To facilitate this coexistence and, above all, combat their proliferation, it has been necessary to understand how they work. This need has led to numerous studies on viruses of various sizes and compositions. Up to now, the results obtained through ensemble measurements contribute to improving our knowledge upon assembly pathways of
viral capsids and their dependence on salt and pH. Indeed, most of the techniques used give average results for an entire population, without being able to access to the inherent heterogeneity of the assembly mechanism. Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) allows us to work not only at the level of the individual capsid, but also at the level of the individual subunit. This experimental setup has been used on the
Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV), whose dimers and single-stranded RNA were fluorescently labelled.
Observing the self-assembly mechanism of this icosahedral virus on a coverslip was achieved after a long optimisation stage of the glass passivation method. The surface chemistry we chose, and the several characterisation steps showed that the fluorescent signals collected corresponded exactly to the specific interactions between labelled subunits and single-stranded RNA. Therefore, these experiments combined to the step-fit algorithm Ruptures enabled us to follow the self-assembly dynamics of CCMV at equilibrium. We accessed to information such as the mean number of capsid subunits per RNA and the time between two consecutive binding events. These initial experiments showed, as expected, an increase in particle size and a decrease in binding rate as the subunit concentration increased. These results, combined with those obtained by mass photometry, indicated that the self-assembly mechanism followed through fluorescence microscopy could be close to give fully formed capsids. Finally, non-equilibrium ex-
periments seemed to suggest that the early steps of assembly were faster when the salt concentration of the medium increased.
La diversité des virus qui nous entourent est telle que nous avons dû apprendre à vivre avec eux. Pour faciliter cette cohabitation et surtout lutter contre leur prolifération, il a fallu comprendre leur mode de fonctionnement. Cette nécessité a donné lieu à de nombreuses études menées sur des virus de tailles et compositions variées. Les résultats obtenus jusqu’alors ont contribué à acquérir des informations d’ensemble sur les voies d’assemblage des capsides virales et leur dépendance quant aux conditions de salinité et pH. En effet, la majorité des techniques utilisées fournissent des résultats moyennés sur toute une population, sans illustrer l’hétérogénéité inhérente au mécanisme d’assemblage. La microscopie de fluorescence par réflexion totale interne nous permet non seulement de travailler à l’échelle de la capside unique mais également de la sous-unité
unique. Ce montage expérimental a été appliqué sur le virus de la marbrure chlorotique de la cornille, dont les dimères de protéines et l’ARN simple brin étaient marqués par deux fluorophores distincts.
L’observation du mécanisme d’auto-assemblage de ce virus sur une lamelle de microscope a nécessité une longue optimisation de la méthode de passivation de cette dernière. La chimie de surface choisie et les différentes caractérisations associées nous ont prouvé que les signaux de fluorescence collectés correspondent bien aux interactions spécifiques entre sous-unités marquées et ARN simple brin. Ainsi, la mise en place de ces expériences couplée à l’utilisation d’un algorithme de détection de marches, Ruptures, nous ont permis de suivre la dynamique d’assemblage à l’équilibre du virus icosaédrique d’intérêt. Nous avons pu accéder à des informations telles que le nombre moyen de sous-unités par ARN ou la durée entre deux accroches consécutives. À la suite des premières expériences réalisées, nous avons observé, comme attendu, une augmentation de la taille des particules formées et une diminution du taux d’accroches quand la concentration totale en sous-unités augmentait. Ces résultats, combinés à ceux obtenus en photométrie de masse, nous ont indiqué que l’assemblage suivi en microscopie de fluorescence pouvait conduire à des capsides complètes. Enfin, les expériences menées hors équilibre semblaient suggérer une accélération des premières étapes d’assemblage lorsque la concentration en sel du milieu augmentait.
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