Mechanical Properties of Septins and Their Role in Establishing Diffusion Barriers
Propriétés mécanique des septines et leur rôle pour établir des barrières de diffusion
Résumé
Septins are ubiquitous filamentous proteins considered as the fourth element of
the cytoskeleton. Septins play a role in the mechanical stabilization of the plasma
membrane and are involved in the establishment of diffusion barriers in vivo, allowing
the compartmentalization of membranes. Even though diffusion barriers are essential
to many cellular processes, the biophysical principles regulating their functions are still
poorly understood. Bottom up in vitro reconstituted systems offer powerful tools to
understand the role of septins in forming those barriers by controlling independently all
the biophysical parameters. During my PhD, I used a system of biomimetic membranes
(liposomes and supported bilayer) to study how the diffusion of lipids and proteins
anchored to membranes is impacted by the presence of a septin mesh.
I have used a combination of methods – namely Fluorescence Recovery After Photobleaching
(FRAP) and Single Particle Tracking (SPT) – to assay the dynamics of
lipids and membrane bound proteins in the presence of yeast septin filaments bound to
biomimetic membranes. I analysed the diffusion of different model proteins, with varying
sizes of the extra-membrane (cytosolic) domains: aquaporin (a transmembrane water
channel with no cytosolic domain), streptavidin (about 6 nm) bound to biotin lipids,
and quantum dots (about 20 nm), bound to the membrane through a streptavidin-biotin
linker. Hence, I have modelled the steric hindrance of membrane bound proteins that
are known to be sequestrated in the presence of septins. The diffusion of lipids is
barely impacted by the presence of septin filaments. However, the diffusion of model
systems mimicking membrane proteins can be altered depending on their dimension.
SPT diffusion analysis shows a freely diffusive behaviour of aquaporin, close to Brownian
motion, while quantum dots, are trapped in linear regions constrained by sets
of parallel septin filaments. Finally, streptavidin displays two distinct populations of
immobile and sub-diffusing particles. Depending on the size of the cytosolic domain,
septins thereby affect differently their diffusive behavior, acting similarly to a “filter”
of membrane bound components. Besides, I have compared the impact of different
structural organization of septins on the diffusion restriction of membrane bound components.
Using human septins or adding cross-linking proteins to yeast septins induce
the self-assembly of orthogonal networks of filaments on membranes. In the presence of
those networks, the diffusion of quantum dots is fully impaired. My observations point
towards a steric effect created by the presence of the septin network and are in good
agreement with the in vivo observations.
Finally, following up previous work, I studied the mechanical properties of lipid
membranes with septin filaments bound. Indeed, septins have been shown to affect the
mechanical properties of plasma membranes and former observations remained puzzling.
I observed, performing micropipette aspiration experiments, that septins were able to
rigidify the membrane, preventing its deformation. I determined, using Atomic Force
Microscopy indentation on GUVs, that septin filaments can reduce the apparent area
compressibility modulus of vesicles, which was unexpected. A model that accounts for
a septin dependent initial deformation of the vesicles can estimate the bending modulus
of a septin mesh. This bending modulus is in good agreement with the known values
of persistence length of single septin filaments and accounts for the counter-intuitive
experimental observation.
Les septines sont des prot´eines filamenteuses ubiquitaires consid´er´ees comme le quatri`
eme ´el´ement du cytosquelette. Elles jouent un rˆole dans la stabilisation m´ecanique
de la membrane plasmique et sont impliqu´ees dans l’´etablissement de barri`eres de diffusion
in vivo, permettant la compartimentation des membranes. Bien que les barri`eres
de diffusion soient essentielles `a de nombreux processus cellulaires, les principes biophysiques
qui r´egissent leurs fonctions sont encore mal compris. Les syst`emes reconstitu´es
in vitro sont de bons mod`eles pour comprendre le rˆole des septines dans la formation de
ces barri`eres car ils permettent le contrˆole de l’ensemble des param`etres biophysiques.
J’ai utilis´e un syst`eme de membranes biomim´etiques (liposomes et bicouche support´ee)
pour ´etudier comment la diffusion des lipides et des prot´eines ancr´ees aux membranes
est modifi´ee en pr´esence d’un r´eseau de septine.
J’ai utilis´e une combinaison de m´ethodes (Recouvrement de Fluorescence Apr`es
Photoblanchiment et Suivi de Particules Uniques) pour analyser la dynamique des lipides
et des prot´eines membranaires en pr´esence de filaments de septines de levure li´es
`a des membranes biomim´etiques. J’ai mod´elis´e l’encombrement st´erique des prot´eines
connues pour ˆetre s´equestr´ees en pr´esence de septines grˆace `a trois prot´eines mod`eles
dont les domaines extra-membranaires (cytosoliques) varient en taille : l’aquaporine (canal
aqueux sans domaine cytosolique), la streptavidine (environ 6 nm) li´ee `a des lipides
poss´edant une biotine, et les points quantiques (environ 20 nm), li´es `a la membrane par
un lien streptavidine-biotine. La diffusion des lipides n’est pratiquement pas affect´ee par
la pr´esence de filaments de septine. En revanche, la diffusion des prot´eines mod`eles est
modifi´ee en fonction de leur dimension. Les exp´eriences de Suivi de Particules Uniques
montrent une diffusion libre de l’aquaporine, proche du mouvement Brownien, tandis
que les points quantiques sont pi´eg´es dans des r´egions lin´eaires contraintes par des filaments
parall`eles de septine. Enfin, la streptavidine pr´esente deux populations distinctes
de particules : immobiles et sous-diffusive. Selon la taille du domaine cytosolique du
mod`ele, les septines affectent donc diff´eremment son comportement diffusif, agissant
de mani`ere similaire `a un ≪ filtre ≫ des composants li´es `a la membrane. En outre, j’ai
compar´e l’impact de l’organisation des filaments de septines sur la restriction de la diffusion
des composants li´es `a la membrane. L’utilisation de septines humaines ou l’ajout
de prot´eines de r´eticulation aux septines de levure induit l’auto-assemblage de r´eseaux
orthogonaux de filaments sur les membranes. En pr´esence de ces r´eseaux, la diffusion
des points quantiques est totalement entrav´ee. Mes observations pointent vers un effet
st´erique cr´e´e par la pr´esence du r´eseau de septines et sont en bon accord avec les
observations in vivo.
Enfin, dans la continuit´e de travaux ant´erieurs, j’ai ´etudi´e les propri´et´es m´ecaniques
de filaments de septine li´es `a des membranes lipidiques. Il a ´et´e d´emontr´e que les septines
affectent les propri´et´es m´ecaniques des membranes plasmiques et les observations
faites lors des ´etudes pr´ec´edentes restaient ´enigmatiques. J’ai observ´e, en r´ealisant des
exp´eriences d’aspiration par micropipette, que les septines ´etaient capables d’empˆechant
la d´eformation de la v´esicule. J’ai d´etermin´e, en utilisant la technique d’indentation par
Microscopie `a Force Atomique sur des GUVs, que les filaments de septine peuvent
r´eduire le module de compressibilit´e surfacique apparent des v´esicules, ce qui ´etait
inattendu. Un mod`ele qui tient compte d’une d´eformation initiale de la membrane
d´ependant de la septine permet d’estimer le module de flexion d’un r´eseau de septine.
Ce module de flexion est en accord avec les valeurs connues de la longueur de persistance
des filaments de septine et explique l’observation exp´erimentale contre-intuitive.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)