Mechanisms of retrograde transport from Golgi apparatus to endoplasmic reticulum - Compartimentation et dynamique cellulaires Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Mechanisms of retrograde transport from Golgi apparatus to endoplasmic reticulum

Mécanismes de transport rétrograde entre l’appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique

Yen-Ling Lian
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1250094
  • IdRef : 269221506

Résumé

Mammalian cells are characterized by the co-existence of multiple pathways, including anterograde and retrograde transport. The Golgi apparatus has a central role in processing and sorting cargos in the bi-directional trafficking. The Retention Using Selective Hooks (RUSH) system allows to synchronize the transport of cargos from the ER to downstream compartments and to systematically analyze the secretory routes. Owing to the interaction of streptavidin (Str) and streptavidin-binding peptide (SBP), the reporter protein can be retained in the ER and then released by the addition of biotin. However, biotin has a high affinity to streptavidin, impairing reversibility of the RUSH assay. With the Artificial Ligands of Streptavidin (ALiS), Golgi-to-ER retrograde transport can be monitored using RUSH upon their washout.The reversible RUSH assay was firstly set up to study two mechanisms of Golgi-to-ER retrograde transport, including the KDEL-mediated retrieval pathway and the glycosylation enzyme recycling pathway. Core streptavidin fused with the ER-retention signal (Str-KDEL), or with the invariant chain (Ii-Str) were used as hooks. Golgi-resident enzymes, ManII* (Mannosidase II)-SBP-EGFP or ST* (Sialyltransferase)-SBP-GFP served as Golgi-targeted RUSH reporters. Our kinetic analysis showed that the Golgi-to-ER transport of ManII* and ST* are both slower through the glycosylation enzyme recycling pathway than the KDEL-meditated retrieval pathway. To characterize the role of putative regulatory factors in KDEL-mediated retrograde transport, we performed RNAi experiments targeting to COG3 and Rab6. Our data showed that knockdown of COG3 resulted in delayed retrograde transport of ManII* and ST*, and the depletion of Rab6 led to impaired trafficking of ST*, consistent with the previous studies. Our data indicated that there are two distinct pathways regulating the retrograde transport of Golgi cargos, including KDEL-mediated ER retrieval and ER recycling of Golgi glycosylation enzymes.Lastly, we have generated endogenous tagged Golgi glycosylation enzymes using CRISPR-Cas9 or CRISPaint knock-in approaches and applied the reversible RUSH assays in the selected clones. The subcellular distribution of endogenous ManIIEN-SBP-mNeonGreen, GalNAc-T1EN-SBP-mNeonGreen and B4GalT1EN-SBP-EGFP were detected in Golgi, and we were able to synchronize the bidirectional transport through the expression of Str-KDEL.
Les cellules de mammifères sont caractérisées par la coexistence de plusieurs voies de transport, dont le transport antérograde et rétrograde. L'appareil de Golgi joue un rôle central dans le traitement et le tri des protéines dans le trafic bidirectionnel. Le système Retention Using Selective Hooks (RUSH) permet de synchroniser le transport des protéines depuis le RE et d'analyser systématiquement les voies sécrétoires. Grâce à l'interaction entre la streptavidine (Str) et un peptide de liaison à la streptavidine (Streptatividin Bioding Peptide, SBP), la protéine rapporteur peut être retenue dans le RE et ensuite libérée par l'ajout de biotine. Cependant, la biotine a une grande affinité pour la streptavidine, ce qui nuit à la réversibilité du test RUSH. Grâce aux ligands artificiels de la streptavidine (ALiS), le transport rétrograde du Golgi vers le RE peut être analysé à l'aide de l’outil RUSH après lab-vage de ALiS.Le test RUSH réversible a d'abord été mis en place pour étudier deux mécanismes de transport rétrograde depuis Golgi vers le RE, notamment la voie médiée par le motif KDEL et la voie de recyclage des enzymes de glycosylation. Str-KDEL ou Ii-Str ont été utilisées comme protéines d’ancrage et les enzymes golgiennes ManII* (Mannosidase II)-SBP-EGFP ou ST* (Sialyltransférase)-SBP-GFP ont été utilisées comme rapporteurs RUSH. Notre analyse cinétique a montré que le transport de l’appareil de Golgi vers le RE de ManII* et de ST* est plus lent par la voie de recyclage des enzymes de glycosylation que par la voie induite par le motif KDEL. Pour caractériser le rôle des facteurs de régulation dans le transport rétrograde médié par le motif KDEL, nous avons réalisé des expériences d'ARNi ciblant COG3 et Rab6. Nos données montrent que la déplétion de COG3 entraîne un retard dans le transport rétrograde de ManII* et ST* et que la déplétion de Rab6 entraîne une altération du trafic de ST*, ce qui est cohérent avec les études précédentes. Nos données confirment l’existence et la différence de cinétique du transport rétrograde Golgi-RE dépendant du motif KDEL et le recyclage des enzymes golgiennes de glycosylation.Enfin, nous avons synchronisé le transport des enzymes golgiennes de glycosylation endogènes en utilisant des approches de knock-in CRISPR-Cas9 ou CRISPaint et l’outil RUSH. La distribution subcellulaire de ManIIEN-SBP-mNeonGreen, GalNAc-T1EN-SBP-mNeonGreen et B4GalT1EN-SBP-EGFP a été détectée dans le Golgi, et nous avons pu synchroniser leur transport bidirectionnel grâce à l'expression de Str-KDEL.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04080838 , version 1 (25-04-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04080838 , version 1

Citer

Yen-Ling Lian. Mechanisms of retrograde transport from Golgi apparatus to endoplasmic reticulum. Cellular Biology. Université Paris sciences et lettres, 2022. English. ⟨NNT : 2022UPSLS067⟩. ⟨tel-04080838⟩
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