Sub optimal 15N metabolic labelling in plant to determine protein turnovers: A new look at the isotopic distribution - CNRS - Centre national de la recherche scientifique Accéder directement au contenu
Poster De Conférence Année : 2021

Sub optimal 15N metabolic labelling in plant to determine protein turnovers: A new look at the isotopic distribution

Marquage métabolique suboptimal de la plante pour la détermination du taux de renouvellement des protéines: Un nouvel intérêt pour la distribution isotopique

Résumé

Protein turnover is a crucial information required to better understand proteostasis and the processes required maintaining the equilibrium between protein synthesis and degradation to balance cellular development and/or environmental stresses. The determination of protein turnover using pulsed SILAC metabolic labelling is popular but, such approach remains difficult with whole organisms and impossible with autotroph species like plants. Alternatively, inorganic sources of 15 N could be metabolically incorporated to de novo synthetized amino acids although 15 N incorporation rates remains sub-optimal. Instead of reaching high 15 N labelling yield (close to 100%), we decide to remain at very low incorporation rates (maximum 5-6%). At such level, the neopeptides isotopic distribution is only moderately modified compared to the peptides natural isotopic distribution. Both labelled and unlabelled products appear as an overlapping isotopic cluster which increases very moderately the peptide mixture complexity during LC-MS/MS analyses. Then, the accurate measurement of the experimental isotopic distribution is mandatory to determine the 15 N yield observed for each characterised peptide over time. Post-acquisition data processing is performed using our free and open sources software including X!TandemPipeline 1 , MassChroQ 2 and "R" specific script 3 already available and/or under development to determine the fold change in protein (FCP) and the labelled protein fraction (LPF) which are required to estimate large scale protein turnover rate.
Le taux de renouvellement des protéines est une information cruciale nécessaire pour mieux comprendre la protéostase et les processus nécessaires au maintien de l'équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines durant le développement cellulaire et/ou en réaction de stress environnementaux. La détermination du taux de renouvellement des protéines à l'aide du marquage métabolique SILAC pulsé est populaire, mais une telle approche reste difficile avec des organismes entiers et impossible avec des espèces autotrophes comme les plantes. Par contre, des sources inorganiques de 15N peuvent être incorporées métaboliquement à des acides aminés synthétisés de novo, bien que les taux d'incorporation du 15N restent sous-optimaux. Au lieu d'atteindre des rendements de marquage 15N élevés (proche de 100%), nous décidons de rester à des taux d'incorporation très faibles (maximum 5-6%). A ce niveau, la distribution isotopique des néopeptides n'est que modérément modifiée par rapport à la distribution isotopique naturelle des peptides. Les produits marqués et non marqués apparaissent sous la forme d'un cluster isotopique se chevauchant ce qui n'augmente que très modérément la complexité du mélange de peptides lors des analyses LC-MS/MS. Ensuite, la mesure précise de la distribution isotopique expérimentale est doit etre déterminé pour estimer le taux d'incorporation du 15N individuellement pour chaque peptide caractérisé en fonction du temps de marquage. Le traitement des données post-acquisition est effectué à l'aide de nos logiciels libres et open source, notamment X!TandemPipeline 1 , MassChroQ 2 et des scripts "R" développés spécifiquement pour se projet pour déterminer la variation de la quantité de proteines (FCP) et la fraction protéine marquée (LPF) qui sont nécessaires lors de l'estimation du taux de renouvellement des protéines à grande échelle.
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Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)

Dates et versions

hal-03683573 , version 1 (31-05-2022)

Identifiants

  • HAL Id : hal-03683573 , version 1

Citer

Willy Vincent Bienvenut, Olivier Langella, Thierry Baillau, Filippo Rusconi, Marlène Davanture, et al.. Sub optimal 15N metabolic labelling in plant to determine protein turnovers: A new look at the isotopic distribution. InPPO meeting, Mar 2021, Vancouvert, Canada. ⟨hal-03683573⟩
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