Study of bacterial conjugation from a practical and fundamental perspective - CNRS - Centre national de la recherche scientifique Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Study of bacterial conjugation from a practical and fundamental perspective

Etude de la conjugaison bactérienne d'un point de vue pratique et fondamental

Résumé

Microbial communities are composed of various bacterial species capable of exchanging genetic information through horizontal gene transfer mechanisms. Among these, bacterial conjugation allows the transfer of large DNA fragments, mostly plasmids, between a donor and a recipient bacterium in direct contact. The acquisition of the plasmid and the expression of the genes carried by it change the recipient into a transconjugant. The product of the genes can confer a symbiotic lifestyle, virulence factors or resistance to heavy metals and antibiotics. It is estimated that conjugation is responsible for 80% of the acquisition of antibiotic resistance in bacteria which is a major public health problem worldwide. In this context, two major objectives are to develop new antibacterial strategies alternative to antibiotics and to better understand the fundamental mechanism of dissemination of resistance by conjugation. Our team combines microscopic and microbiological analyses at the single cell and population scales to understand the process and dynamics of conjugation. My thesis project aimed to explore practical and fundamental aspects of this mechanism. First, I developed a novel antibacterial strategy based on conjugation-delivered plasmids carrying CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein) systems. The CRISPR system is capable of recognizing and targeting specific DNA sequences and introducing lethal double-strand breaks to DNA of bacteria. We have therefore created plasmids mobilized by conjugation , called TAPs (Targeted-Antibacterial-Plasmids), able to specifically killing bacteria in a population. By platting assays, flow cytometry and fluorescence microscopy techniques I was able to show the ability of TAPs to be transferred and to kill targeted strains. We also showed that TAPs could re-sensitize a bacterial population to an antibiotic. In addition to this biotechnological application, I also studied the dynamics of bacterial conjugation at the cellular level, using the F-plasmid as a model. I explored the timing of expression of plasmid genes once transferred into the recipient bacterium as well as the establishment of antibiotic resistance after plasmid acquisition. I was interested in the genes located on the first part of the plasmid to enter in the recipient, called "leading region". I was able to show that unlike other plasmid genes, these are transiently expressed only in the transconjugant and not in the donor. This first result suggested an expression strategy that would allow first the establishment of the transferred plasmid, its maintenance and then its transfer to another recipient. I also studied the acquisition of tetracycline resistance conferred by the F plasmid carrying a specific TetA efflux pump that allows the efflux of tetracycline from the cell. Using fluorescence microscopy, we were able to observe and analyze the dynamics of real-time TetA production and tetracycline efflux in cells carrying the F plasmid. Our study shows that tetracycline resistance depends on a balance between TetA production and the ability of tetracycline to block this production. Furthermore, we were able to correlate the increase in the intracellular amount of TetA with the ability of the cells to resist increasing amounts of tetracycline.
Les communautés microbiennes sont composées d’espèces bactériennes variées capables d’échanger des informations génétiques par des mécanismes transfert horizontal de gènes. Parmi ceux-là, la conjugaison bactérienne permet le transfert de large fragments d’ADN, la plupart du temps des plasmides, entre une bactérie donneuse et une receveuse en contact direct. L’acquisition du plasmide et l’expression des gènes portés par celui-ci changent la receveuse en transconjugant. Le produit des gènes peuvent conférer un mode de vie symbiotique, des facteurs de virulence ou une résistance aux métaux lourds ainsi qu’aux antibiotiques. On estime que la conjugaison est responsable de 80 % de l'acquisition de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries qui constitue un problème de santé publique majeur dans le monde entier. Dans ce contexte, deux objectifs majeurs sont de développer des nouvelles stratégies antibactérienne alternatives aux antibiotiques ainsi que de mieux comprendre le mécanisme fondamental de dissémination de la résistance par conjugaison. Notre équipe combine analyses microscopiques et microbiologiques à l’échelle de la cellule unique et populationnelle pour comprendre le processus et la dynamique de de conjugaison. Mon projet de thèse visait à explorer des aspects pratiques et fondamentaux de ce mécanisme. J’ai tout d’abord développé une stratégie antibactérienne innovante basée sur des plasmides délivrés par conjugaison et portant des systèmes CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein). Le système CRISPR est capable de reconnaître et de cibler des séquences d'ADN spécifiques et d'introduire des cassures double-brin létales pour les bactéries. Nous avons donc créé des plasmides renommés TAPs (Targeted-Antibacterial-Plasmids) mobilisables par conjugaison, capables de tuer spécifiquement des bactéries au sein d’une population. Par des techniques de dénombrements, de cytométrie en flux et microscopie à fluorescence j’ai pu montrer la capacité des TAPs à être transférés et à tuer la souche ciblée. Nous avons également montré que le TAPs pouvaient re-sensibiliser une population bactérienne à un antibiotique. Outre cette application biotechnologique, j'ai également étudié la dynamique de conjugaison bactérienne à l'échelle cellulaire, en utilisant comme modèle le plasmide F. J’ai exploré le timing d'expression des gènes plasmidiques une fois transféré dans la bactérie receveuse ainsi que l'établissement de la résistance aux antibiotiques après l'acquisition du plasmide. Je me suis intéressée aux gènes se situant sur la première partie du plasmide à entrer dans la receveuse, appelée « leading region ». J’ai pu montrer que contrairement aux autres gènes plasmidiques, ceux-ci sont exprimés transitoirement uniquement dans les transconjugant et non chez la donneuse. Ce premiers résultats ont suggéré une stratégie d’expression qui permettrait d’abord l’établissement du plasmide transféré, sa maintenance puis son transfert à une autre receveuse. J’ai également étudié l’acquisition de la résistance à la tétracycline conférée par le plasmide F portant une pompe à efflux spécifique TetA qui permet d’éjecter la tétracycline hors de la cellule. Grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence, nous avons pu observer et analyser la dynamique de production de TetA en temps réel et l’efflux de tétracycline dans les cellules portant le plasmide F. Notre étude montre que la résistance à la tétracycline dépend d'un équilibre entre la production de TetA et la capacité de la tétracycline à bloquer cette production. De plus, nous avons pu corréler l’augmentation de la quantité intracellulaire de TetA avec la capacité des cellules à résister à de plus en plus grandes quantités de tétracycline.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03836249 , version 1 (02-11-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03836249 , version 1

Citer

Audrey Reuter. Study of bacterial conjugation from a practical and fundamental perspective. Microbiology and Parasitology. Université de Lyon, 2021. English. ⟨NNT : 2021LYSE1257⟩. ⟨tel-03836249⟩
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