La phosphorylation oxydative mitochondriale des blastes : biomarqueur prédictif de la survie des patients atteints de leucémies aigues myéloïdes - CNRS - Centre national de la recherche scientifique Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Mitochondrial oxidative phosphorylation of blasts : a predictive biomarker of survival in patients with acute myeloid leukemia

La phosphorylation oxydative mitochondriale des blastes : biomarqueur prédictif de la survie des patients atteints de leucémies aigues myéloïdes

Résumé

Acute myeloid leukemia (AML) is a group of malignant hemopathies characterized by the clonal expansion in the bone marrow of blood cell precursors blocked at an early stage of differentiation, leukemic blasts. Diagnosis and monitoring of the disease are based on various biological and biochemical examinations of blood and bone marrow blasts. AML are particularly aggressive hemopathies with a 5-year survival rate of 24%. One of the reasons for this poor survival is the fact that even if two-thirds of patients initially respond to treatment, the majority of them will eventually relapse. Currently, the orientation of the therapeutic choice is based on the evaluation of cytogenetic and molecular criteria which lead to the classification into prognostic groups identified according to the recommendations of the ELN. However, this classification has limitations. To improve its predictability, new complementary biomarkers must be identified and characterized. During this thesis, we first developed a robust and reliable methodology to measure the oxygen consumption of leukemic cells of AML patients in order to assess the different states of mitochondrial oxidative phosphorylation as a potential functional biomarker of LAM. We then applied this methodology to measure the various metabolic parameters of blasts obtained from the blood of 58 patients with AML isolated at the time of diagnosis.We first developed a protocol to measure, using the Seahorse XFe24, the different states of mitochondrial oxygen consumption of blasts isolated from the marrow or blood. We have shown that it was possible to measure the energy metabolism of these cells directly after collection, after 18 hours of post-collection cultures or after cultivation following their cryopreservation in liquid nitrogen. These protocols were developed in order to measure : the consumption of mitochondrial oxygen (whether or not coupled to ATP synthesis), as well as the spare respiratory capacity (SRC) which corresponds to the capacity of cells to accelerate the respiratory chain after exposure to the FCCP protonophore.Then from a prospective cohort study (58 patients), we evaluated the different states of mitochondrial oxygen consumption of blasts obtained from the blood of patients with AML. Biostatistical analyzes, based on the calculation of the hazard-ratio, determined that SRC was significantly correlated with patient survival. After discretization of the SRC, we established a threshold distinguishing two groups of patients. Patients with blasts with SRC greater than 75 pmol O2.min-1.150 000 cells-1 exhibit significantly higher survival than patients with blasts with SRC below this threshold.The SRC evaluated by oximetry is a value relating to the acceleration capacity of the respiratory chain of cells after exposure to the protonophore FCCP. We have therefore characterized the biochemical events associated with this acceleration from different AML cell lines or blasts from patients. Using pharmacological inhibitors (BPTES, UK5099 and Etomoxir), RNA interference approaches (MPC2 knock-down) and metabolomics analyzes (after incubation with [U13C] -Glucose or [U13C] - Glutamine), we demonstrated that the oxidation of pyruvate via pyruvate dehydrogenase was a major pathway activated during the acceleration of respiratory chain activity induced by FCCP. Conversely, mitochondrial oxidation of glutamine is not necessary in this context.In conclusion, we have shown that there is heterogeneity in the oxidative metabolism of blasts obtained from the blood of AML patients and that SRC can distinguish two groups of patients whose survival is significantly different. These results establish a solid methodological basis that can be used clinically and show the interest of SRC as a potential biomarker to complement the current biomarkers used to establish the ELN classification.
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un ensemble d'hémopathies malignes caractérisées par l'expansion clonale dans la moelle osseuse de précurseurs de cellules sanguines bloqués à un stade précoce de leur différenciation, les blastes. Le diagnostic et le suivi de la maladie reposent sur différents examens biologiques et biochimiques des blastes du sang et de la moelle osseuse. La faible survie observée dans les LAM, 24% 5 ans après le diagnostic, s’explique entre-autre par le fait que même si deux tiers des patients répondent initialement au traitement, la majorité d’entre eux finiront par rechuter. L’orientation du choix thérapeutique repose sur l’évaluation de critères cytogénétiques et moléculaires qui conduisent à la classification en groupes pronostiques identifiés selon les recommandations de l’ELN. Cependant cette classification présente des limites. Pour améliorer sa prédictivité, de nouveaux biomarqueurs complémentaires doivent être identifiés et caractérisés. Au cours de cette thèse, nous avons dans un premier temps développé une méthodologie robuste et fiable pour mesurer la consommation d'oxygène de cellules leucémiques de patients atteints de LAM afin d'évaluer les différents états de la phosphorylation oxydative mitochondriale comme potentiel biomarqueur fonctionnel des LAM. Puis nous avons appliqué cette méthodologie pour mesurer les différents paramètres métaboliques des blastes issues du sang de 58 patients atteints de LAM isolées au moment du diagnostic.Nous avons d'abord développé un protocole pour mesurer, à l'aide du Seahorse XFe24, les différents états de la consommation d’oxygène mitochondriale de blastes isolés de la moelle ou du sang. Nous avons montré qu’il était possible de mesurer le métabolisme énergétique de ces cellules directement après le prélèvement, après 18 heures de cultures ou après la mise en culture suite à leur cryoconservation. Ces protocoles ont été développés afin de mesurer : la consommation d'oxygène mitochondriale (couplée ou non à la synthèse d'ATP) et la capacité de réserve respiratoire (SRC) qui correspond à la capacité des cellules à accélérer la chaine respiratoire après exposition au protonophore FCCP.A partir d'une étude de cohorte prospective (58 patients), nous avons évalué les différents états de la consommation d'oxygène mitochondriale de blastes issues de sang de patients atteints de LAM. Les analyses biostatistiques, basées sur le calcul du risque relatif instantané (hazard ratio, HR), ont déterminé que SRC était significativement corrélée à la survie des patients. Après discrétisation de la SRC, nous avons établi un seuil distinguant deux groupes de patients. Les patients présentant des blastes avec une SRC supérieure à 75 pmol d’O2.min-1.150 000 cellules-1 présentent une survie significativement plus élevée que les patients avec des blastes dont la SRC est inférieure à ce seuil.Nous avons caractérisé les événements biochimiques associés à l'accélération de la chaîne respiratoire à partir de différentes lignées de LAM ou de blastes issus de patients. En utilisant des inhibiteurs pharmacologiques (BPTES, UK5099 et Etomoxir), des approches d'ARN interférence (knock-down MPC2) et des analyses de métabolomiques (après incubation avec de l’[U13C]-Glucose ou de l’[U13C]-Glutamine), nous avons démontré que l'oxydation du pyruvate via la pyruvate déshydrogénase était une voie majeure activée durant l’accélération de l’activité de la chaîne respiratoire induite par le FCCP.En conclusion, nous avons démontré qu’il existait une hétérogénéité du métabolisme oxydatif des blastes issues du sang de patients atteints de LAM et que la SRC permettait de distinguer deux groupes de patients dont la survie est significativement différente. Ces résultats établissent une base méthodologique solide utilisable en clinique et montrent l’intérêt de la SRC en tant que potentiel biomarqueur pour compléter les biomarqueurs actuels utilisés pour établir la classification ELN
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03940423 , version 1 (16-01-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03940423 , version 1

Citer

Quentin Fovez. La phosphorylation oxydative mitochondriale des blastes : biomarqueur prédictif de la survie des patients atteints de leucémies aigues myéloïdes. Biologie cellulaire. Université de Lille, 2021. Français. ⟨NNT : 2021LILUS068⟩. ⟨tel-03940423⟩
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