New insights into the mechanisms of transcription termination by RNA polymerase III - CNRS - Centre national de la recherche scientifique Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

New insights into the mechanisms of transcription termination by RNA polymerase III

Étude sur les différents mécanismes de terminaison de la transcription par l'ARNpol III

Juanjuan Xie
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1255338
  • IdRef : 269960864

Résumé

Transcription is the process whereby RNA molecules are synthetized using DNA as the template. In eukaryotic cells, this process is carried out by three different kinds of RNA polymerases (RNAP). RNAPI is mainly responsible for the production of rRNA, RNAPII transcribes protein-coding genes and several classes of non-coding genes and RNAPIII is mostly dedicated to the synthesis of tRNAs, 5S rRNA as well as a few short non-coding RNAs. The genomic distribution of different polymerases needs to be tightly controlled to avoid disruptive interferences between adjacent transcription events, which largely depends on the process of transcription termination. The current model posits that RNAPIII termination relies solely on a stretch of thymines (T-tract) in the non-template DNA strand that are presumably sufficient for both RNAPIII pausing and its release from the DNA. However, previous results from our group identified an interaction between RNAPIII and a well-characterized RNAPII transcription termination factor, the helicase Sen1, which prompted us to investigate a possible role for Sen1 in the termination of RNAPIII transcription in budding yeast. In this study, to address specifically the function of Sen1 in RNAPIII transcription termination I have employed a Sen1 mutant (sen1-3) containing three point mutations in a conserved region of the Sen1 N-terminal domain, which are sufficient to abolish the interaction with RNAPIII without affecting RNAPII transcription termination. By generating high-resolution maps of transcribing RNAPIII, I have observed that a significant fraction of RNAPIIIs normally read through the primary terminator (i.e. the first T-tract downstream of the 3' end of genes). Importantly, I have shown that the mutations in sen1-3 induce transcription termination defects at most RNAPIII-dependent genes, indicating that Sen1 is globally required for efficient termination of RNAPIII transcription in vivo, and that this function relies on the interaction of its N-terminal domain with RNAPIII. In addition, I have shown that Sen1 acts mainly at read-through regions as a fail-safe mechanism to promote termination of RNAPIIIs that override the primary terminator. In order to explore whether Sen1 can directly induce the release of RNAPIII from the DNA, I have performed in vitro transcription termination assays with purified proteins. First, I have tested the termination efficiency at T-tracts of different lengths and I have shown that six consecutive thymines are sufficient for RNAPIII transcription termination in vitro. Furthermore, I have demonstrated that Sen1 can promote termination at weak terminators (i.e. containing 4 or 5 Ts), as well as at other kind of pausing sequences. By analysing the function of several Sen1 variants, I have shown that the helicase domain of Sen1 alone can induce transcription termination of RNAPIII in vitro as the full-length protein. Moreover, I have found that Sen1-mediated termination requires Sen1 binding to the RNA and Sen1 ATP hydrolysis activity. Our results indicate that Sen1 employs a similar mechanism to promote transcription termination of both RNAPII and RNAPIII. Finally, I have found that hairpin-like structures that typically form at RNAPIII transcripts near the primary terminator can also stimulate RNAPIII release at weak terminators. Moreover, I have obtained evidence that hairpin-like structures can form inside the polymerase. I have also shown that the presence of these structures hinders the loading of Sen1 onto the RNA, indicating that Sen1 and RNA hairpins work in a mutually exclusive manner. While Sen1 can promote release of RNAPIII at pausing sites other than T-tracts, I have found that RNA structures can only work together with a canonical termination sequence. Taken together, our data offer a detailed model for RNAPIII transcription termination, which in budding yeast involves the cooperation of T-tracts, RNA secondary structures and the helicase Sen1.
La transcription est le processus par lequel les molécules d'ARN sont synthétisées en utilisant l'ADN comme matrice. Chez les eucaryotes, ce processus est réalisé par trois types d'ARN polymérases (ARNpol). L'ARNpol I est responsable de la production d'ARNr, l'ARNpol II transcrit les gènes codant pour de protéines et certains gènes non-codants et l'ARNpol III est surtout dédiée à la synthèse des ARNt, de l'ARNr 5S ainsi que d'autres ARN non-codants courts. La distribution des différentes polymérases dans le génome doit être finement contrôlée pour éviter les interférences entre les gènes adjacents, ce qui dépend largement de la terminaison de la transcription. Selon le modèle actuel, la terminaison de l'ARNpol III repose uniquement sur une suite de thymines (T) dans le brin d'ADN non-matrice qui serait suffisant pour induire une pause de l'ARNpol III et sa dissociation de l'ADN. Cependant, mon groupe a précédemment trouvé une interaction entre l'ARNpol III et l'hélicase Sen1, un facteur de terminaison de la transcription de l'ARNpol II bien caractérisé, ce qui nous a incités à étudier un rôle possible de Sen1 dans la terminaison de la transcription de l'ARNpol III chez la levure bourgeonnante. Pour élucider la fonction spécifique de Sen1 dans la terminaison de l'ARNpol III, j'ai utilisé un mutant (sen1-3) contenant trois mutations ponctuelles dans le domaine N-terminal de Sen1, qui sont suffisantes pour abolir son interaction avec l'ARNpol III sans affecter la terminaison de la transcription de l'ARNpol II. En générant des cartes à haute résolution de la transcription par l'ARNpol III, j'ai observé qu'une fraction significative d'ARNpol III lit normalement à travers le terminateur primaire (c'est-à-dire la première suite de Ts en aval de l'extrémité 3' des gènes). J'ai montré que les mutations dans sen1-3 induisent des défauts de terminaison dans la plupart des gènes dépendants de l'ARNpol III, ce qui indique que l'interaction de Sen1 avec l'ARNpol III est globalement requise pour une terminaison efficace de la transcription de l'ARNpol III in vivo. De plus, j'ai montré que Sen1 agit principalement comme un mécanisme de "fail-safe" pour promouvoir la terminaison des ARNpol IIIs qui dépassent le terminateur primaire. Afin d'explorer si Sen1 peut induire directement la dissociation de l'ARNpol III de l'ADN, j'ai réalisé des essais de terminaison de la transcription in vitro avec des protéines purifiées. Tout d'abord, j'ai montré que six Ts consécutives sont nécessaires pour une terminaison efficace de la transcription par l'ARNpol III in vitro. De plus, j'ai démontré que Sen1 peut promouvoir la terminaison au niveau des terminateurs faibles contenant 4 ou 5 Ts, ainsi que d'autres types de séquences de pause. Ensuite, j'ai montré que le domaine hélicase de Sen1 peut induire la terminaison de l'ARNpol III de façon similaire à la protéine entière in vitro. De plus, j'ai découvert que la terminaison médiée par Sen1 nécessite la liaison de Sen1 à l'ARN et l'activité ATPasique de Sen1, comme montré précédemment pour la terminaison de la transcription de l'ARNpol II. Enfin, j'ai découvert que les structures secondaires qui se trouvent généralement sur les ARN transcrits par l'ARNpol III peuvent aussi complémenter la fonction des terminateurs faibles. J'ai également montré que la présence de ces structures empêche l'interaction de Sen1 avec l'ARN, ce qui indique que Sen1 et les structures de l'ARN fonctionnent d'une manière mutuellement exclusive. Alors que Sen1 peut favoriser le relâchement de l'ARNpol III de différents types de séquences, les structures d'ARN ne peuvent fonctionner qu'avec une séquence de terminaison canonique. Ensemble, nos données offrent un modèle détaillé pour la terminaison de la transcription de ARNpol III qui implique la coopération des suites de Ts, des structures secondaires d'ARN et de l'hélicase Sen1.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04100280 , version 1 (17-05-2023)

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  • HAL Id : tel-04100280 , version 1

Citer

Juanjuan Xie. New insights into the mechanisms of transcription termination by RNA polymerase III. Genetics. Université Paris Cité, 2021. English. ⟨NNT : 2021UNIP7321⟩. ⟨tel-04100280⟩
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