Réaction d'hydroxylation aromatique catalysée par une hydroxylase flavine-dépendante à deux composants : le système ActVA-ActVB de Streptomyces coelicolor - BIG - Chimie et Biologie des Métaux (CBM) Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2005

Aromatic hydroxylation reaction catalyzed by the two compenent flavin-depedent system ActVA-ActVB from Streptomyces Coelicolor

Réaction d'hydroxylation aromatique catalysée par une hydroxylase flavine-dépendante à deux composants : le système ActVA-ActVB de Streptomyces coelicolor

Julien Valton
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 941514

Résumé

The two-component flavin-dependent monooxygenases belong to an emerging class of enzymes involved in oxidation reactions in a number of metabolic and biosynthetic pathways in microorganisms. One component is a NAD(P)H:flavin oxidoreductase which provides a reduced flavin to the second component, the proper monooxygenase. Here, we study the two-component system ActVB and ActVA-OrF5, reported to be involved in the last step of biosynthesis of the natural antibiotic actinorhodin in Streptomyces coelicolor. ActVB has been already reported to be a NADH:flavin oxidoreductase able to catalyze the reduction of free flavin by NADH by a sequential ordered mechanism. Here, for the first time, we show that ActVA-Orf5 is an FMN-dependent monooxygenase which together with the help of ActVB, catalyze the aromatic hydroxylation of its natural substrate DHK. The mechanism of the transfer of FMN between ActVB and ActVA-Orf5 has been investigated. Dissociation constant values for FMNox and FMNred with regard to ActVB and ActVA-Orf5 have been determined. The results clearly demonstrate that FMNred has a better affinity for ActVA than for ActVB whereas FMNox has a better affinity for ActVB than for ActVA. In full agreement with this finding, our data clearly indicate a thermodynamic transfer of FMNred from ActVB to ActVA-Orf5, without involving a particular interaction between the two protein components. In addition, we show that in the presence of FMNred and molecular oxygen, the ActVA active site accommodates and stabilizes an electrophilic hydroperoxyflavin intermediate species. This intermediate reacts efficiently with the nucleophilic species DHK to form its hydroxylated analogue: DHK-OH. In agreement with these data, we found that the electron rich hydroquinone form of DHK was an excellent substrate whereas the quinone was not. ActVA-ActVB system does not seem to be highly specific because the enantiomer of DHK, the NNM-A, as well as the lactonic analogue of NNM-A, the NNM-D, are also substrates in their hydroquinones forms. However, DHK is a much better substrate than NNM-A and NNM-D. Finally, the previously postulated product of the ActVA-ActVB system, the antibiotic actinorhodin, was not formed in our experiments and the last step of its biosynthesis need to be reinvestigated.
Il y a une dizaine d'années, de nouvelles flavoenzymes nommées hydroxylases flavine-dépendantes à deux composants ont été identifiées chez certains microorganismes. Le rôle physiologique de ces enzymes est maintenant bien connu. Elles sont impliquées dans les processus de biosynthèse et de biodégradation d'une multitude de molécules organiques. Ces hydroxylases sont composées de deux enzymes distinctes. La première est une flavine réductase qui catalyse la formation de flavine réduite nécessaire au fonctionnement de la seconde enzyme, une monooxygénase flavine-dépendante. Au début de notre projet, le mécanisme enzymatique de ces nouvelles hydroxylases était encore inconnu. Pour comprendre le détail de leur fonctionnement, nous avons choisi d'étudier le système ActVA-ActVB, un nouveau membre de la famille des hydroxylases flavine-dépendantes impliqué dans la dernière étape de biosynthèse de l'actinorhodine, un antibiotique naturel synthétisé par Streptomyces coelicolor. La caractérisation préalable de ActVB avait permis de montrer que cette enzyme était une NADH:FMN oxydoréductase capable de catalyser la réduction du FMN par le NADH selon un mécanisme de type séquentiel ordonné. Nos résultats ont permis d'identifier ActVA-Orf5, une monooxygénase flavine-dépendante capable d'utiliser la flavine réduite fournie par ActVB pour catalyser l'hydroxylation du précurseur de l'actinorhodine, la DHK. Le mécanisme de transfert de flavine entre les deux protéines a été étudié. Pour cela, les constantes de dissociation du FMNox et FMNred vis-à-vis de ActVA et ActVB ont été déterminées. Nos donnés montrent clairement qu'à l'état réduit, la flavine est bien plus affine pour la monooxygénase ActVA que pour la réductase ActVB alors qu'à l'état oxydé, elle possède une meilleure affinité pour la réductase que pour la monooxygénase. Cette différence d'affinité permet d'orienter le transfert de flavine d'une protéine à l'autre sans nécessiter d'interaction entre les deux protéines. Nous avons montré de plus que ActVA avait la capacité de stabiliser un intermédiaire activé de l'oxygène, une espèce électrophile nommée C(4a)-hydroperoxyflavine, au sein de son site actif. Cet intermédiaire réagit très rapidement avec la DHK nucléophile pour former son analogue hydroxylé : la DHK-OH. En accord avec ce mécanisme, il semble que le pouvoir nucléophile du substrat est très important pour cette réaction car seule la forme réduite à deux électrons de DHK (hydroquinone) est hydroxylée. D'autre part, ActVA ne semble pas être très spécifique car elle parvient également à catalyser l'hydroxylation de l'énantiomère de la DHK, la NNM-A et de l'analogue lactonique de la NNM-A, la NNM-D. Finalement le système ActVA-ActVB n'a pas la capacité de dimériser la DHK-OH pour former l'actinorhodine et l'enzyme intervenant dans la dernière étape de cette biosynthèse reste à identifier.
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Dates et versions

tel-00823949 , version 1 (19-05-2013)

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  • HAL Id : tel-00823949 , version 1

Citer

Julien Valton. Réaction d'hydroxylation aromatique catalysée par une hydroxylase flavine-dépendante à deux composants : le système ActVA-ActVB de Streptomyces coelicolor. Biochimie [q-bio.BM]. Université de Grenoble, 2005. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00823949⟩
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