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Thèse Année : 2023

Roles of RNA Helicases and ncRNAs in genome spatial and functional organisation

Rôles des hélicases d'ARN et des ARN non-codants dans l'organisation spatiale et fonctionnelle du génome

Résumé

Genes transcription is one of the foremost nuclear processes, influencing cells and organisms at virtually all stages of life and development. It is therefore tightly controlled to ensure proper gene expression programs and avoid deleterious mis-regulations. In the last decades, the blooming fields of Chromatin and Epigenetic have become prevalent in the study of gene expression regulations. Truly, from nucleosomes and their modifications, to the large-scale 3D structures formed to mediate and constraint spatial interactions of genomic elements, all the components of chromatin have been demonstrated as influential in controlling transcription at all steps. Insulator elements, for example, were found to limit spatial contacts between neighbouring regions to avoid unwanted regulatory interactions, thus forming Topologically Associating Domains (TADs). More recently, transcription was shown to happen not only at defined genes, but more pervasively in nearly all contexts. Notably, Enhancers and Promoters, the two main genomic elements enabling gene transcription, are transcribed into relatively unstable non-coding RNAs, named eRNAs and PROMPTs, which are thought to participate in gene regulation. The search for the various factors that mediate and influence genome organisation, both spatially and functionally, is still ongoing, with new roles and factors discovered regularly. Insulators in particular have been shown in the last two decades to be composed of around 15 proteins in Drosophila, and at least 4 in Human. Recently, RNAs, and in particular non-coding RNAs, have been proposed as regulators of insulator proteins, influencing their binding and oligomerization at specific loci. In this context, we found several RNA helicases in interactions with insulator complexes in Drosophila melanogaster S2 cells. Hence, we focused on three of these RNA helicases, namely Mtr4, Rm62 (DDX5 in Human) and Abstrack (DDX41 in Human), to decipher their potential roles as insulator co-factors. In this study, we use predominantly genome-wide sequencing and bioinformatic analyses to investigate coding and non-coding RNAs regulations (RNAseq), as well as the recruitment and binding to chromatin of several insulator proteins (ChIPseq), and the influences of these RNA helicases on 3D chromosome conformation (HiC). We complement these genomic approaches with microscopy experiments to examine the impact of RNA helicases and ncRNAs on the formation of transcriptional and insulator condensates. Finally, we also make a proof-of-concept experiment using CRISPR-dCas9 to target the accumulation of specific eRNAs and thus potentially enact changes in insulator recruitment and gene expression. Despite our relative lack of understanding of the underlying mechanisms, we have identified that all three RNA helicases have contextualized effects that depend on the type of insulator complexes that are considered. We propose that these helicases exert different effects and at different sites, possibly through separate mechanisms. Thus, we support that RNA helicases may be an important branch of insulator complexes regulators that account for some of the previously described loci-dependent behaviour of insulators. Along this course, the global accumulation of non-coding RNAs upon depletion of Mtr4 has also permitted us to study the effects of non-coding RNAs accumulation when uncoupled from their transcription, a current subject of intense debate in the field. This study brings new evidence of the diversity of mechanisms impacted by non-coding RNAs and their regulation, laying the ground for future investigations of local chromatin regulations by RNAs.
La transcription des gènes est un processus nucléaire majeur qui influence les organismes et les cellules à toutes les étapes de leur développement. La transcription est donc précisément contrôlée pour assurer le bon fonctionnement des processus transcriptionnels. Au cours des dernières décennies, les domaines de la chromatine et de l'épigénétique sont devenus prévalents dans l'étude de la régulation de l'expression des gènes. Des nucléosomes et leurs modifications jusqu'aux larges structures 3D formées pour médier et contraindre les interactions des éléments génomiques, l'importance de la chromatine dans le contrôle de la transcription a été démontré à toutes ses étapes. Par exemple, les insulateurs limitent les contacts entre régions voisines pour empêcher certaines interactions régulatrices délétères, formant ainsi les Domaines Topologiquement Associés (TADs). Plus récemment, il a été découvert que la transcription n'a pas lieu seulement sur des gènes bien définis, mais de manière plus pervasive. Ainsi, les Promoteurs et les Enhancers, éléments principaux permettant la transcription des gènes, sont transcrits en ARN non-codants appelés PROMPTs et eRNAs. Ces derniers sont également proposés comme régulateurs de l'expression des gènes La recherche des divers facteurs qui composent et influencent l'organisation du génome, à la fois spatialement et fonctionnellement, est encore en cours, tandis que de nouveaux facteurs et rôles sont régulièrement découverts. Parmi ceux-ci, les insulateurs sont composés d'environ 15 protéines chez la Drosophile, et au moins 4 chez l'Humain. Récemment, les ARNs, et en particulier les ARNs non-codants, ont été proposés comme régulateurs des protéines insulatrices, influençant leur liaison et leur oligomérisation à certains loci. Dans ce contexte, nous avons découvert plusieurs hélicases d'ARNs en interaction avec les complexes insulateurs dans des cellules S2 de Drosophila melanogaster. Nous nous sommes alors concentrés sur 3 de ces hélicases d'ARNs, à savoir Mtr4, Rm62 (DDX5 chez l'Humain) et Abstrakt (DDX41 chez l'Humain), pour caractériser leur potentiel rôle de co-facteurs d'insulateurs. Dans cette étude, nous utilisons principalement des méthodes de séquençage du génome entier analysés en bio-informatique, pour mesurer la régulation des ARNs codants et non codants (RNAseq), le recrutement à la chromatine de plusieurs facteurs insulateurs (ChIPseq) ainsi que l'influence de ces hélicases d'ARN sur la conformation des chromosomes (HiC). Nous complémentons ces approches génomiques par des analyses en microscopie portant sur l'impact de ces hélicases d'ARNs et des ARN non-codants sur la formation des condensats insulateurs et des condensats de transcription. Enfin, nous avons produit une preuve de concept pour cibler l'accumulation de eRNAs spécifiques par CRISPR-dCas9, et donc potentiellement modifier l'expression des gènes et le recrutement des insulateurs. Malgré notre manque de compréhension des mécanismes sous-jacents, nous avons pu déterminer que les 3 hélicases d'ARN d'intérêt ont des effets contextuels dépendants du type de complexe insulateur considéré. Nous proposons que ces hélicases aient des rôles différents, à des sites distincts, potentiellement via plusieurs mécanismes. Nous émettons l'hypothèse que les hélicases d'ARN soient un groupe important de potentiels régulateurs des complexes insulateurs. Ils pourraient alors expliquer une partie des changements de comportement des insulateur en fonction des sites. Au cours de cette étude, l'accumulation globale d'ARNs non-codants nous a permis d'évaluer leur effet indépendamment de leur transcription, ce qui fait encore débat dans ce domaine. Cette étude apporte de nouveaux éléments quant à la diversité des mécanismes impactés par les ARN non-codants et leur régulation et pose les bases de futures investigations relatives aux régulation locales de la chromatine par les ARN.
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Dates et versions

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  • HAL Id : tel-04575726 , version 1

Citer

Olivier Fosseprez. Roles of RNA Helicases and ncRNAs in genome spatial and functional organisation. Cellular Biology. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2023. English. ⟨NNT : 2023TOU30299⟩. ⟨tel-04575726⟩
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