Toxicologie développementale sur les larves de moules : apport des méthodes d’immunohistochimie, d’hybridation in situ et d’imagerie pour l’étude fine des tissus - CNRS - Centre national de la recherche scientifique Accéder directement au contenu
Article Dans Une Revue Revue Française d'Histotechnologie Année : 2023

Developmental toxicology on mussel larvae: contribution of immunohistochemistry, in situ hybridization and imaging for the detailed study of tisues

Toxicologie développementale sur les larves de moules : apport des méthodes d’immunohistochimie, d’hybridation in situ et d’imagerie pour l’étude fine des tissus

Rémi Dumollard
Angelica Miglioli

Résumé

Larval development of the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis is a well-established model to assess the effects of environmental stressors on marine invertebrates. However, the scarce understanding of the processes regulating larval development in bivalve mollusks prevents the comprehension of their modes of action in these organisms. Accordingly, we devised live staining, whole mount in situ hybridization (WMISH) and immunostaining protocols to investigate in detail shell biogenesis and neurogenesis. These two major morphogenetic processes characterize M. galloprovincialis larval ontogeny and are extremely susceptible to both environmental contaminants and global change. Larval shell biogenesis was studied at close times post fertilization (pf) starting by the early trochophore stage (24 hours pf) until the D-Veliger stage (48 hours pf) with the two live dyes Calcofluor and Calcein which, respectively, stain the organic and calcified portion of the growing shell. During the same developmental window, early neurogenesis was studied with antibodies against the neurotransmitters serotonin (5-HT) and γ-aminobutyric acid (GABA). In addition, WMISH was performed to study the onset of dopaminergic (DOPA) neurons and the global neuronal population. Our results show that shell biogenesis starts at the trochophore stage with the secretion of a saddle-shaped organic matrix providing the scaffold for the following mineral deposition. At this same stage, mussel larvae already present a copious neuronal population which include both 5-HT and GABA positive cells, while DOPA neurons only appear at later stages. In D-Veligers, the shell is D-shaped with the organic and inorganic layers growing at the same rate while neurons, especially 5-HT, are organized in protoganglions. These techniques and findings allowed us to demonstrate neurotoxic as well as direct effects on the early stages of shell biogenesis for diverse stressors including Endocrine Disruptors.
Le développement larvaire de la moule méditerranéenne Mytilus galloprovincialis est un modèle bien établi pour évaluer les effets des facteurs de stress environnementaux sur les invertébrés marins. Cependant, les processus régulant le développement larvaire chez les mollusques bivalves sont encore très peu connus. Nous avons conçu des protocoles d'hybridation in situ (HIS), d'immunomarquage et de colorations vitales pour étudier la biogénèse de la coquille et la neurogénèse, processus morphogénétiques extrêmement sensibles aux contaminants environnementaux et au changement climatique. La biogenèse de la coquille larvaire qui commence au stade trochophore précoce (24 heures post fécondation (hpf)) jusqu'au stade D-véligère (48 heures pf) est quantifiée par marquage avec les deux colorants vitaux Calcofluor et Calcéine qui, respectivement, colorent la matrice organique et la partie minérale de la coquille en croissance. Au cours de la même fenêtre de développement, la neurogénèse précoce a été étudiée avec des anticorps dirigés contre les neurotransmetteurs sérotonine (5-HT) et acide γ-aminobutyrique (GABA). En outre, des HIS ont été réalisées pour étudier l'apparition des neurones dopaminergiques (DOPA) et la population neuronale globale. Nos résultats montrent que la biogenèse de la coquille commence dès le stade trochophore et qu'à ce stade larvaire les moules présentent déjà une population neuronale qui comprend à la fois des cellules 5-HT et GABA positives, tandis que les neurones DOPA n'apparaissent qu'au stade pré-véligère. Chez les D-véligères, la coquille est en forme de D tandis que les neurones, en particulier 5-HT, sont organisés en proto-ganglions. Ces techniques et découvertes nous ont permis de démontrer des effets neurotoxiques ainsi que des effets directs sur la biogenèse de la coquille par des perturbateurs endocriniens connus.
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Rémi Dumollard, Angelica Miglioli. Toxicologie développementale sur les larves de moules : apport des méthodes d’immunohistochimie, d’hybridation in situ et d’imagerie pour l’étude fine des tissus. Revue Française d'Histotechnologie, 2023, 35 (1), pp.45-72. ⟨10.25830/afh.rfh.2023.35.1.45⟩. ⟨hal-04426513⟩
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